活体荧光多重成像分析可以对小动物活体状态下的生物过程进行组织、细胞和分子水平的定性和定量研究，是辅助科研人员理解疾病发生机制、进行药物研发和临床精确诊断的重要技术。然而在实际应用中，该技术仍面临着成像深度浅、分辨率差、对比度低和可检测通道数量少等诸多挑战，其中缺乏光谱分离的近红外荧光探针是制约该技术进步的重要因素。那么，能否开发出一套光谱分离的近红外荧光探针工具，让科学家们可以更全面地窥视活体动物中的生命活动呢？
7月29日，《自然·材料》（Nature Materials）期刊在线发表了复旦大学化学系教授张凡团队的科研成果。这篇以《铒-细菌叶绿素杂化近红外荧光探针用于生物医学多重成像》（“A hybrid erbium (III)-bacteriochlorin near-infrared probe for multiplexed biomedical imaging”）为题的论文，为以上难题的攻克提供了全新的思路与可能。这也是复旦大学通过交叉学科研究取得的又一重要成果。
复旦大学化学系博士生王婷、博士后王尚风共同为第一作者；复旦大学化学系教授张凡为通讯作者。研究工作得到了复旦大学化学系、聚合物工程国家重点实验室、上海市分子催化和功能材料重点实验室、国家重点研发项目、国家自然科学基金委员会、中国博士后科学基金会、上海市科学技术委员会等机构与项目的大力支持。
技术进步：近红外荧光成像逐步应用于活体多重检测分析
荧光是自然界中的一种光致发光现象。因其灵敏度高，分辨率好且具有实时性等特点，荧光成像在生命科学、药学和医学诊断等领域都有着非常广阔的应用前景。借助于多种荧光探针的标记，人们还能同时通过多个不同波长的信号组合，实现多个待测物的同时多通道检测。
过去，体外诊断或者细胞成像是研究者们的主要目的，因而传统的可见光（波长400~700 nm）区荧光探针即可满足要求。随着科学研究的不断深入，人们越来越需要理解活体动物原位微环境的生物学机制，但由于生物体内不同的组织（如皮肤、脂肪、骨骼等）对激发光和发射光均具有不同程度的散射和吸收作用，使得在这个区间内的光学穿透深度和成像分辨率都不理想。这种现象就好比是在大雾天看风景，不仅看不清也看不远。
近红外（波长700~1700 nm）窗口逐渐被证实是一个生物组织的光学“透明”窗口。近红外光在穿透皮肤、脂肪和骨骼等生物组织时发生的散射和吸收现象均较少，因而相对于可见光而言其“折损率”更低。不仅如此，在近红外区域，来自于生物体内各种色素的自发荧光也极大的降低。在这两大优势的助力下，近红外区域内的荧光成像在活体动物研究中有着较好的表现与巨大的发展前景。
然而在实际应用中，近红外活体荧光多重成像仍旧不理想，其潜力还未得到完全释放。当前使用的荧光探针普遍光谱较宽，吸收发射挨的近，因而无法对生物组织进行无串扰的多重标记与成像。
研究突破：构建光谱分离的近红外荧光探针实现高对比度的活体多重成像
针对以上难题，张凡团队开发了一种基于稀土铒离子与细菌叶绿素配位的新型近红外荧光探针体系，实现了光谱分离的活体荧光多重成像。稀土铒离子配合物具有1530 nm左右的特征单色发光特性，理论上非常适合用来进行活体荧光成像研究。然而要在生理环境下实现这一发光却并不容易。传统的分子构建策略不仅容易导致铒离子的发光被水分子淬灭，而且分子的激发波长常常在紫外光区，无法在活体成像中进行应用。研究人员发现自然界中的紫细菌能够利用细菌叶绿素高效地捕捉近红外光并将光能转换为化学能。
受此启发，张凡团队提出了以细菌叶绿素作为天线配体敏化稀土铒离子的新颖策略，所构造出的荧光探针不仅能在水相中发射出明亮的近红外荧光，而且其吸收和发射半峰宽小于32 nm，斯托克斯位移值达到了760 nm，为活体荧光多重成像的实现提供了强有力的研究工具。
团队利用超快光谱技术和低温磷光光谱分析揭示了细菌叶绿素和铒离子之间存在高效的三重态能量转移过程，并且进一步通过分子工程调控了配体的吸收，验证了围绕铒-细菌叶绿素体系开发多色可调近红外荧光探针工具的可行性。
图1：（a）铒-细菌叶绿素配合物的能量传递机理图；（b）铒-细菌叶绿素配合物的代表性分子EB766的化学结构式；（c）EB766的单晶结构；（d）EB766的吸收和发射光谱图；（e）超快瞬态吸收光谱表征EB766的激发态动力学过程。
图2：（a-c）基于新型近红外荧光探针构建的激发光谱分离多重成像方案，
实现了小鼠血管和淋巴管结构的高分辨率成像；
（d-g）基于新型近红外荧光探针构建的发射光谱分离多重成像方案，
实现了癌细胞在小鼠脑部转移的动态实时可视化观察。
最后，张凡团队基于探针优异的光学特性和生物相容性进行了生物成像研究。探针较窄的吸收光谱特性使得通过正交激发控制的多重成像方法可以清晰地勾勒出小鼠血管和淋巴管的精细结构及其空间位置关系，并能实时显现胃肠道消化系统和血液循环系统的代谢活动。该方法有望为手术导航和临床诊断提供更精准的信息。团队进一步利用新型探针标记了小鼠体内的癌细胞，探针较窄的发射光谱特性也让正交发射控制的多重成像方法得以在小鼠脑部以无创伤的方式清晰地观察到癌细胞的运动、迁移、以及在血管壁上驻扎等过程。相比于原先的研究方法，这种方法有效地避免了开视窗造成的组织损伤，以及昂贵的成像设施，为活体水平的细胞互作研究提供了新的研究平台。
该研究目前已经取得了较好的初步应用效果，未来还需要更进一步地提高探针的发光效率，增加颜色通道以更好的满足活体内高通量多重检测的应用需求。此外，改善探针分子的功能修饰特性，增强与前沿生物与成像技术的兼容性等问题仍然有待后续研究。但这一科研成果所点亮的诸多可能，都将为化学与材料科学、生物医学光子学、生命科学、生物医学工程和医疗诊断等领域拓宽研究视野与前行的方向。
论文链接：https://www.nature.com/articles/s41563-021-01063-7
